如何確定發(fā)光測量的微孔板間的交叉污染？

如何確定發(fā)光測量的微孔板間的交叉污染？

北京亙辰科技有限公司  Frank Han

    過去十幾年，發(fā)光實驗因具有*的特異性及靈敏度，且簡單易用，多應(yīng)用于藥物開發(fā)研究。現(xiàn)代光學(xué)測量儀器，即便發(fā)光底物的光子發(fā)射水平極低依然能夠準(zhǔn)確進(jìn)行計數(shù)。引起研究者們對SBS / ANSI標(biāo)準(zhǔn)微孔板設(shè)計中固有的光學(xué)干擾以及信噪比的極大關(guān)注。這篇短文比較了三個不同品牌制造商的微孔板中觀察到的光學(xué)干擾，發(fā)現(xiàn)使用黑色基底孔板可顯著提高檢測的靈敏度。

分光光度法

    該研究比較了兩個不同品牌制造商的固體白色聚苯乙烯矮板與獲得的Porvair Sciences設(shè)計的白色單孔與實心黑色基底板的組合（圖1）。用螢火蟲熒光素酶的發(fā)光測定做對比。有三種基于微孔板檢測獲得光學(xué)數(shù)據(jù)的方法。zui簡單的方法是吸光度測量。根據(jù)Beer-Lambert定律，測量透射或吸收的單色光，可簡單測出每孔中的相對濃度。酶標(biāo)儀使用原理。

圖 1. Porvair *的白孔黑底96孔熒光檢測板

    熒光檢測靈敏度更高。在熒光計中，簡單的截止濾波器可以從檢測光中去除反射的激發(fā)波長，僅留下發(fā)射波長。靈敏度卻是吸光度測量法的10倍以上。通過使用單色儀降低激發(fā)和發(fā)射波長的帶寬來實現(xiàn)更高的靈敏度。這種熒光計可以增加一個數(shù)量級的靈敏度。

生物發(fā)光是某些動物和植物物種展示的自然發(fā)光現(xiàn)象，有水母發(fā)光蛋白和螢光素兩種常見發(fā)光機(jī)制。通過用熒光素酶基因構(gòu)建轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光素酶可以用作報告基因以評估細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性或為高通量篩選提供測定細(xì)胞凋亡的ATP濃度，檢測非常靈敏。這種發(fā)光測定法由幾家生命科學(xué)公司以AequoScreen ^TM，LucLite ^TM，ATPLite ^TM，OneGlo ^TM命名。發(fā)光計或多標(biāo)記讀取儀是能夠讀取吸光度，熒光或發(fā)光模式的多用途光譜儀。圖2為三種光學(xué)檢測方法。

圖2:光度法檢測

微板設(shè)計考慮

    用于檢測開發(fā)和高通量篩選的微孔板通常由聚苯乙烯聚合物制造。

    當(dāng)在篩選中使用熒光素酶在孔板上觀察高動態(tài)范圍出現(xiàn)困難時，相鄰的孔若顯示過強(qiáng)或過弱的信號，會導(dǎo)致孔之間的光學(xué)干擾，而得出錯誤的結(jié)果。一定量的可見光通過板的白色塑料孔壁“泄漏”，低信號也會在相鄰孔板中被錯誤附加而被檢測到。當(dāng)讀取與低濃度信號相鄰的更亮的孔時，誤差zui大。使用分離的“煙囪”設(shè)計可以減少這種誤差，但卻不能消除誤差。圖3顯示Porvair白色固體96孔“煙囪”板（左圖）。每個孔具有與板矩陣分離的單獨形成的孔壁。

為了克服白色塑料孔壁的光“泄漏”問題，Porvair Sciences開發(fā)*的96孔黑底白孔板并獲得了。（圖3右圖）。的“雙射”工藝技術(shù)使得黑色聚苯乙烯板基底與白色孔板結(jié)合。這種“雙射”模具也用于制造具有透明底板的白色或黑色孔壁的熒光檢測板，Porvair Sciences Krystal 2000^TM零干擾板便是底部讀取吸光度和熒光檢測的耗材。其配方中含有高達(dá)18％TiO₂的亮白色孔板結(jié)合1％炭黑基底上，該板的光學(xué)干擾全部被消除。

數(shù)據(jù)表明：Porvair的黑底白孔板與其他兩個制造商的固體白板相比較，黑白板的孔間干擾分別降低82％和56％。

研究方法

在BMG Labtech的POLARStar Omega光譜儀使用5ul含有熒光素和螢火蟲熒光素酶的溶液移液到每個96孔板的C4孔中（在下面的數(shù)據(jù)中顯示為“P”）并在510nm處讀數(shù)。加入5uL等分的過氧化氫反應(yīng)。從每個樣品孔周圍的空的孔中讀取四個數(shù)值，每個讀數(shù)持續(xù)1秒，取平均值。熒光素酶信號在8-10分鐘內(nèi)快速衰減，信號下降到幾乎為初始水平的50％時讀數(shù)。

每個實驗準(zhǔn)備一個板，注意從未開封的包裝中選擇干凈板。其他品牌的孔板重復(fù)該流程。使用相同類型的空白板做背景讀數(shù)以進(jìn)行信噪比計算。

圖3. 樣品位置和樣品周圍的各個測量位置

結(jié)果

Porvair 96孔黑白板的計算信噪比為192000：1，而實心白板的信噪比為178000：1，背景顯示有用的可測量信號增加7.5％。

結(jié)論

   結(jié)果清楚地表明，Porvair科學(xué)的復(fù)合黑底白孔板提供了用于篩選和藥物開發(fā)中低水平熒光素酶的測定。通過炭黑的有效淬滅和二氧化鈦增加反射率的組合產(chǎn)生*的信噪比和*的動態(tài)范圍，使篩選者有機(jī)會在較低的檢測水平或減少試劑濃度的情況下篩選微弱的信號。

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關(guān)于Porvaier-Sciences

    Porvair-Sciences，微孔板產(chǎn)品的制造專家，服務(wù)生命科學(xué)，生物技術(shù)，醫(yī)藥研發(fā)和分子生物學(xué)的微孔板解決方案的所有應(yīng)用，也為各*生物公司設(shè)計zui通用的過濾板，包括Waters，Millipore，Qiagen，Whatman，GE Healthcare，Varian，Biotage、當(dāng)然還有Porvair。